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检验检测

经验分享:如何正确认识新冠病毒核酸检测中的内标基因

上海市临床检验中心
   浏览量: 1424   发表时间: 2022-08-02 21:44
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核酸检测作为新冠肺炎感染者的确诊依据,在疫情防控中发挥着至关重要的作用。“内标”基因作为体现核酸检测质量的重要指标之一,通常指实时荧光定量PCR中的内参基因,能够对单个待测样本本身的检测环节进行监测,可作为质控品的有力补充。

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目前获批的核酸检测试剂盒基本都已经加入“内标”,主要分为“外源性内标”和“内源性内标”两种,下面我们结合实验室经常遇到的“样本内标扩增异常”情况,与大家讨论一下,在质控满足要求时,如何正确的认识核酸检测中的内标基因。



“外源性内标”和“内源性内标”的区别

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常见异常内标曲线及可能原因分析


对于“外源性内标”


靶基因和内标均无扩增

常见原因:无法明确是否存在检验前问题,多数为检验中内标样本错加漏加、核酸加样时错加漏加;若连续多个样本存在此情况,首先考虑提取试剂、提取仪的问题。


靶基因有扩增但内标无扩增

常见原因:应先明确靶基因是否同内标基因存在竞争或抑制作用,若不存在,原因同上,且该扩增孔存在污染可能。


例图1: 典型的高浓度样本抑制内标基因扩增。

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图 1 靶基因有扩增但内标无扩增


外源性内标基因扩增明显离散

常见原因:外源性内标最大特点为均匀性好,故个别样本内标离散时多为反应体系中存在抑制物;部分连续样本内标离散时,应首先考虑提取试剂、提取仪的问题;若整板样本内标离散时,多为扩增体系配制时未充分混匀。

例图2: 该样本反应体系中存在抑制物。

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图 2 单个样本内标基因离散


例图3: 由于磁珠残留、加热模块异常,造成多个连续样本内标基因离散。

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图 3 多个样本内标基因离散


以上应对措施

更换试剂、耗材、仪器等条件进行复检;重新采样检测并严格按照sop操作等。



对于“内源性内标”


检验人员需首先明确

内源性内标有扩增不代表采样成功,原因有3点:

1.对于混采样本,只需1个受试者采样成功,内源性内标就会有扩增;

2.以RNase P内标为例,如不能正确采样,仅采集口腔甚至皮肤样本,同样会有内源性内标扩增;

3.环境中可能会存在人源性样本气溶胶污染。但是,采样不成功时,内源性内标一定无扩增。



靶基因和内标均无扩增

常见原因:实验室较为常见,涉及范围较广,包括检验前样本采集、保存、运送问题;检验中反应体系、提取、扩增问题以及人员操作问题等。


靶基因有扩增但内标无扩增

常见原因:情况极其少见,因内源性内标基因与靶基因通常无竞争或抑制作用,所以原因同上,且该扩增孔可能存在污染或非特异性扩增。

例图4: 采样失败且靶基因非特异性扩增。

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图 4 靶基因非特异性扩增且内标无扩增



内源性内标基因扩增明显离散

常见原因:由于采样质量直接影响内标扩增结果,故曲线较离散属于正常情况,并不一定是人员不规范操作引起的,所以这种情况较难界定。

例图5: 若排除检验前问题,整体内标曲线相对离散,可能由于样本未充分振荡混匀或扩增体系配制时未充分振荡混匀。

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图 5内标基因离散



以上应对措施

更换试剂、耗材、仪器等条件进行复检;重新采样检测并严格按照sop操作等。


其他常见的异常内标曲线


曲线明显分为两簇

常见原因:

1.可能是提取仪异常导致提取效率低,多为加热模块故障、磁珠异常或磁珠残留;

2.可能所用的反应液放置时间过长导致扩增效率下降;

3.可能是不同的采样管内的存液对提取试剂的提取效率有影响。

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图 6 扩增曲线分为两簇


内标曲线不平滑(靶基因曲线正常)

常见原因:多为错用扩增程序,如A试剂反应体系使用了B试剂的扩增程序,可重新选择正确的荧光通道。

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图 7 内标曲线不平滑

 

总结

不同的内标都各有利弊,实验室应根据具体的使用需求,科学看待和选择。即“有内标不一定行,但无内标一定不行”。


核酸检测过程中的每一个操作环节都有可能影响检测结果,所以实验室必须规范化管理,出现样本内标异常结果时也应细心观察、耐心分析,采样人员采样时也应规范合理,最终保证核酸检测的质量,为疫情防控保驾护航。